г. Обнинск, пр. Ленина 93, (2 этаж)
8(484)392-01-31;  8(900)572-06-77

Акции и новости

Пенсионерам в будние дни до 13.00:
-женская стрижка от 350 руб.
-окрашивание волос от 600 руб.
-мужская стрижка от 100 руб.

 

Новинка - Ботокс для волос подробнее

НОВАЯ УСЛУГА В САЛОНЕ "ВУАЛЬ" ПРИКОРНЕВОЙ ОБЪЁМ ВОЛОС Fleecing Technology
подробнее
 

THERMOKERATIN - инновационная процедура салонного ухода за окрашенными и натуральными волосами. 
подробнее


 

Пиобактериофаг при грибке


ПИОБАКТЕРИОФАГ ПОЛИВАЛЕНТНЫЙ (СЕКСТАФАГ) 20МЛ N4 ФЛАК

Лечение и профилактика гнойно-воспалительных и энтеральных заболеваний, вызванных стафилококками, стрептококками, протеями, клебсиеллами, синегнойной и кишечной палочками:

— заболевания уха, горла, носа, дыхательных путей и легких - воспаления пазух носа, среднего уха, ангина, фарингит, ларингит, трахеит, бронхит, пневмония, плеврит;

— хирургические инфекции - нагноение ран, ожоги, абсцесс, флегмона, фурункулы, карбункулы, гидраденит, панариции, парапроктит, мастит, бурсит, остеомиелит;

— ypoгенитальные инфекции - уретрит, цистит, пиелонефрит, кольпит, эндометрит, сальпингоофорит;

— посттравматические конъюнктивиты, кератоконъюнктивиты, гнойные язвы роговицы и иридоциклиты;

— энтеральные инфекции - гастроэнтероколит, холецистит, дисбактериоз;

— генерализованные септические заболевания;

— гнойно-воспалительные заболевания новорожденных - омфалит, пиодермия, конъюнктивит, гастроэнтероколит, сепсис и др.;

— другие заболевания, вызванные бактериями стафилококков, стрептококков (в том числе энтерококков), протея, клебсиелл пневмонии, синегнойной и кишечной палочек.

При тяжелых проявлениях инфекций, вызванных стафилококками, стрептококками, протеем, клебсиеллой пневмонии, синсгнойной и кишечной палочками, препарат назначается в составе комплексной терапии.

С профилактической целью препарат используют для обработки операционных и свежеинфинированных ран, а также для профилактики внутрибольничных инфекций по эпидемическим показаниям.

Важным условием эффективной фаготерапии является предварительное определение фагочувствительности возбудителя.

границ | Адаптированные бактериофаги для лечения инфекций мочевыводящих путей

Введение

Возникновение и повторное возникновение множественных устойчивых к антибиотикам бактериальных инфекций и их быстрое распространение в окружающей среде привело к новому росту научного интереса к терапии бактериофагами как альтернативе антибиотикам. Использование бактериофагов для лечения бактериальных инфекций было предложено французско-канадским ученым Феликсом д’Эреллем в 1917 году. С тех пор бактериофаговая терапия применяется в различных областях медицины для лечения различных бактериальных инфекций (Chanishvili, 2012).Однако после открытия пенициллина в 1940-х годах западные научные общества отдали предпочтение антибактериальной терапии, в то время как многие врачи и исследователи в республиках бывшего Советского Союза оставались приверженцами терапии бактериофагами и продолжали использовать ее отдельно или в сочетании с антибиотиками (Чанишвили, 2012), дополнительные ссылки см. Также в Дополнительных материалах, частично на русском языке.

Симптомы нижних мочевыводящих путей (СНМП) - частая проблема у взрослых мужчин, которая сильно влияет на качество жизни (Martin et al., 2011). Традиционно СНМП были связаны с обструкцией выходного отверстия мочевого пузыря, которая часто вызывается увеличением простаты (Abrams et al., 2002). Увеличение предстательной железы происходит примерно у 25% мужчин в возрасте от 50 до 30% и у 50% мужчин в возрасте 80 лет и старше (Kupelian et al., 2006). Трансуретральная резекция простаты (ТУРП) считается краеугольным камнем хирургического лечения СНМП, вызванных доброкачественной обструкцией простаты (Cornu et al., 2015). Эти пациенты имеют соответствующий риск инфекций мочевыводящих путей (ИМП) (Schneidewind et al., 2017). Помимо возможного образования остаточной мочи, которая действует как питательная среда для бактерий (Truzzi et al., 2008), многие из этих пациентов полагаются на краткосрочную или долгосрочную катетеризацию перед дальнейшим лечением. Однократное введение катетера вызывает инфекцию в 1–2% случаев, в то время как катетеры с открытыми дренажными системами вызывают бактериурию почти в 100% случаев в течение 3–4 дней (Warren, 1992; Bonkat et al., 2018).

Поэтому мы решили совместить ТУРП с терапией бактериофагами, используя бактериофаги как замену периоперационным антибиотикам.Настоящее исследование было разработано как проспективное двухэтапное (первая фаза: адаптация бактериофага, вторая фаза: лечение коммерчески доступным, но адаптированным бактериофагом Pyo), предшествующее рандомизированному плацебо-контролируемому двойному слепому клиническому исследованию (Leitner et al. , 2017) для оценки эффективности и безопасности адаптированных бактериофагов для лечения (связанных с катетером) ИМП (Nicolle et al., 2005; Hooton et al., 2010; Bonkat et al., 2018) у пациентов, перенесших ТУРП.

Пациенты и методы

Утверждение комитета по этике

Это проспективное двухэтапное исследование было одобрено местным комитетом по этике (TNCU-02/283; Тбилиси, Грузия) и проводилось в Национальном центре урологии Александра Цулукидзе (TNCU), Тбилиси, Грузия, и в Институте бактериофага Элиава. , Микробиология и вирусология (EIBMV), Тбилиси, Грузия.Исследование было разработано как исследование, предшествующее рандомизированному контролируемому исследованию (РКИ), зарегистрированному на ClinicalTrials.gov: NCT03140085 (Leitner et al., 2017).

Пациенты

С сентября 2016 г. 130 пациентов, которым была запланирована ТУРП, были обследованы в рамках подготовки к РКИ (Leitner et al., 2017) в TNCU. На первом этапе оценивались посевы мочи от всех пациентов (взятых в середине потока мочи или из существующего трансуретрального или надлобкового катетера). В целом, 118 (91%) из 130 пациентов, прошедших скрининг, имели положительные посевы мочи на заранее определенные уропатогены (т.е., Staphylococcus aureus , E. coli , Streptococcus spp., Pseudomonas aeruginosa , Proteus mirabilis ) и ≥10 4 колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл. Выделенные культуры последовательно подвергали тесту in vitro на чувствительность бактериофага к коммерчески доступному и зарегистрированному в Грузии раствору бактериофага Pyo (Eliava BioPreparations Ltd., Тбилиси, Грузия), который подвергался циклам адаптации, как описано в следующем абзаце.На втором этапе девять пациентов, у которых была определена чувствительность к коктейлю, были дополнительно подвергнуты лечению бактериофагами без ослепления. Критериями исключения были симптоматические ИМП, микроорганизмы, нечувствительные к бактериофагу Pyo, и возраст до 18 лет. У всех пациентов до операции были собраны данные о размере предстательной железы, простатоспецифическом антигене (ПСА), Международной шкале симптомов простаты (IPSS) (Barry et al., 1992), максимальной скорости потока и остаточном количестве после мочеиспускания. Был собран удаленный объем простаты и определены гистологические результаты.Забор посевов мочи повторяли через 7 дней после операции или во время каких-либо побочных эффектов. Письменное информированное согласие было получено от всех включенных пациентов.

Приготовление и адаптация бактериофагов

Чтобы охватить разнообразие уропатогенов, для лечения ИМП использовался коммерческий препарат под названием Бактериофаг Pyo, производимый компанией Eliava BioPreparations Ltd., Тбилиси, Грузия. Этот коктейль бактериофагов состоит из линий бактериофагов, активных против широкого спектра уропатогенных бактерий: Staphylococcus aureus, E.coli, Streptococcus spp. (включая стрептококки группы D, переименованные в настоящее время в Enterococcus spp.), Pseudomonas aeruginosa и Proteus spp. урологических инфекций (Чанишвили, 2012). Как это общепринято, коммерческие коктейли бактериофагов, включая бактериофаг Pyo, регулярно адаптируются EIBMV с целью повышения эффективности коктейля бактериофагов против вновь возникающих патогенов (Kutter et al., 2010; Villarroel et al., 2017; McCallin и другие., 2018). Также в нашем исследовании мы применили адаптацию для повышения эффективности и охвата уропатогенных штаммов, которые изначально имели промежуточную или устойчивую оценку в исследовании чувствительности in vitro , аналогично тому, как это было сделано в ранее проведенном исследовании in vitro (Sybesma et al. ., 2016). Метод основан на протоколе Аппельманса для титрования бактериофагов (Appelmans, 1921) и отбирает h-мутанты с более широким и более сильным взаимодействием хозяин-бактериофаг (Merabishvili et al., 2018). Подобно определению минимальной ингибирующей концентрации для антибиотиков (Levison and Levison, 2009), метод Аппельманса основан на жидкостном титровании бактериофагов и определяет самую низкую концентрацию бактериофагов, которые проявляют оптическую прозрачность в течение 24–72 ч в суспензии с предварительно отобранные бактериальные штаммы, устойчивые к коктейлю бактериофагов. Это разведение с наименьшей концентрацией бактериофагов, точка отсечения, обозначается отрицательными значениями степени.Если исходный титр бактериофага был 10 -1 , он может стать 10 -2 или 10 -3 с каждым раундом разбавления, что указывает на то, что более активные единицы бактериофага были способны убивать бактерии и что тестируемые бактерии становятся менее устойчивыми к адаптированным бактериофагам.

Последующий титр бактериофагов определяется двумя методами: титрованием в жидкости (Appelmans, 1921) и титрованием с использованием метода двухслойного агара (Gratia, 1936).Титрование проводится для каждого компонента, входящего в состав бактериофагов Pyo, отдельно на стандартном наборе культур-хозяев (т. Е. Титр бактериофагов E. coli определяется на наборе стандартных штаммов E. coli , титр Компонент стафилококка определяется на наборе стандартных штаммов стафилококка и др.). Таким образом оценивается титр бактериофагов в диапазоне 10 7 –10 9 бляшкообразующих единиц на мл (БОЕ / мл).Однако титр отдельных (адаптированных) клонов, входящих в одну группу бактериофагов, может варьироваться (McCallin et al., 2018).

Микробиологическая оценка и тест на чувствительность к бактериофагам

На первом этапе образцы мочи наносили тройными штрихами на хромогенную среду Uriselect TM 4 (Bio-Rad Laboratories, Марн-ла-Кокетт, Франция) для количественной оценки и квалификации уропатогенных микроорганизмов. Положительные посевы мочи оценивали под микроскопом на предмет окраски по Граму и морфологии.Для всех штаммов бактерий были проведены тесты на чувствительность к антибиотикам и фагам. При обнаружении подходящих микроорганизмов, потенциально поддающихся лечению бактериофагом Pyo ( S. aureus , E. coli, Streptococcus spp., P. aeruginosa, P. mirabilis ), были обнаружены посевы мочи в EIBMV для дальнейшего скрининга на бактериофаг. чувствительность. Для этого образцы мочи были повторно культивированы, и их идентичность была повторно проверена. Как только те же подходящие микроорганизмы были культивированы, был проведен скрининговый анализ лизиса бактериальных клеток, как описано ранее (Sybesma et al., 2016). Если результаты in vitro и показали четкий сливающийся лизис на чашке Петри с бактериальным газоном, он был классифицирован как чувствительный (рис. 1). В адаптационных циклах использовали устойчивые и среднеустойчивые штаммы. В случае чувствительности бактериофаг Пио был отправлен в больницу для начала лечения. Через семь дней после ТУРП снова собирали пробы мочи, трижды культивировали на вышеупомянутой хромогенной среде Uriselect TM 4 и повторно оценивали.

РИСУНОК 1. Различные степени лизиса бактериальной культуры за счет активности бактериофага. Результаты в верхней строке (для бактериофага Pyo и бактериофага Intesti) рассматриваются как «S» (чувствительные), а результаты в нижней строке (бактериофаг Ses и бактериофаг Enko) считаются как «I» (промежуточные). Примечание. Бактериофаги Pyo, Intesti, Ses и Enko являются коммерчески доступными коктейлями с бактериофагами. Фотография была сделана во время ранее проведенной работы (Sybesma et al., 2016), в которой использовалось несколько различных коктейлей с бактериофагами.

Внутрипузырное лечение бактериофагом

Трансуретральная резекция простаты была выполнена в соответствии с общей хирургической практикой с использованием монополярного резектоскопа (May and Hartung, 2006). Для орошения под низким давлением каждому пациенту был установлен надлобковый троакар. Периоперационная антибиотикопрофилактика не проводилась. После ТУРП были размещены надлобковый катетер и трансуретральный катетер для поддержания ирригации. Трансуретральный катетер был удален через 24–48 часов. Надлобковый катетер оставляли на месте в течение 7 дней, чтобы обеспечить возможность инстилляции адаптированного бактериофага Pyo.Пио бактериофаг вводился лечащим врачом два раза в сутки (т.е. 8.00, 20.00) в течение 7 дней, начиная с первого дня после операции. Раствор объемом 20 мл оставался в мочевом пузыре примерно 30–60 мин.

Оценка безопасности и клинических / микробиологических результатов

Все нежелательные явления в течение фазы лечения регистрировались в соответствии с рекомендациями Международной конференции по гармонизации (ICH) по надлежащей клинической практике (GCP) (E6) (Международная конференция по гармонизации, 1996 г.) и Международной организацией по стандартизации (ISO 14155) (Международная Организация по стандартизации, 2011).Потенциальная эффективность оценивалась с использованием клинических / микробиологических параметров и определялась как отсутствие клинических признаков инфекции и снижение КОЕ / мл.

Параметры результата

Первичные: (а) чувствительность уропатогенных штаммов к коммерчески доступному, но адаптированному бактериофагу Pyo (первая фаза) и (b) эффект внутрипузырного лечения адаптированным бактериофагом Pyo (вторая фаза).

Вторичный: Возникновение / отсутствие нежелательных явлений в соответствии с категоризацией в соответствии с Общими критериями терминологии для нежелательных явлений Национального института рака (CTCAE) версии 4 для степени 1–5 во время лечения бактериофагом (вторая фаза).

Статистический анализ

Использовалась описательная статистика. Данные представлены в виде процентов или среднего ± стандартное отклонение. Из-за ограниченного числа субъектов дальнейший статистический анализ не проводился.

Результаты

Первая фаза: in vitro Циклы тестирования чувствительности к бактериофагам и адаптации

Распределение бактериальных штаммов у 118 включенных пациентов показано на рисунке 2. 24% и 17% всех штаммов были чувствительными и промежуточными по отношению к первоначально используемому бактериофагу Pyo (т.е.е., общая чувствительность 41%), Рисунок 3А. После четырех циклов адаптации чувствительность и промежуточная чувствительность увеличились до 41% и 34% (то есть общая чувствительность 75%), рис. 3B.

РИСУНОК 2. Пропорциональное распределение бактериальных штаммов. Посевы мочи 118 включенных пациентов показали следующее распределение бактериальных штаммов: E. coli был обнаружен преимущественно с 41%, затем Enterococcus spp. с 29%, Streptococcus spp.с 20%, Pseudomonas aeruginosa с 8%, Staphylococcus spp. 7%, Proteus spp. 4% и другие 9%.

РИСУНОК 3. Пропорциональное распределение чувствительных, промежуточных и устойчивых штаммов среди 118 клинических образцов до (A) и после (B) четырех циклов адаптации коктейля бактериофагов Pyo.

Вторая фаза: лечение адаптированным пиобактериофагом

Характеристики пациентов приведены в таблице 1.Средний возраст составлял 69 ± 12 лет, анкетирование IPSS выявило СНМП от умеренной до сильной (IPSS 20 ± 2). Средний размер простаты составил 77 ± 37 мл, все значения ПСА находились в пределах непатологического диапазона. Максимальная скорость потока составляла 11 ± 3 мл / с при среднем остатке после мочеиспускания 80 ± 100 мл. Двум пациентам перед операцией был установлен постоянный катетер. Среднее время операции 48 мин, осложнений при операции на простате не было. Гистологические результаты выявили доброкачественную гиперплазию предстательной железы во всех случаях, у пяти пациентов была выявлена ​​интраэпителиальная неоплазия предстательной железы высокой степени, но злокачественных заболеваний обнаружено не было.

ТАБЛИЦА 1. Обобщение результатов внутрипузырного лечения бактериофагом Pyo, проведенного у девяти пациентов.

До лечения посев мочи выявил E. coli у четырех, Streptococcus spp. в двух - Enterococcus spp. у двух и P. aeruginosa у одного из девяти пациентов. После лечения у четырех пациентов не было обнаружено значительного роста бактерий, тогда как у E. coli и Enterococcus spp.были по-прежнему изолированы из посевов мочи четырех и одного пациента, соответственно. У шести из девяти пациентов (67%) титры бактерий снизились после лечения бактериофагом (таблица 1).

Не было обнаружено никаких побочных эффектов, связанных с бактериофагами. У одного пациента лечение антибиотиками (цефалоспорин третьего поколения) было начато на 3-й день после развития лихорадки (> 38,0 ° C), и симптомы исчезли в течение 48 часов. Посев мочи показал P. aeruginosa.

Обсуждение

Анализ in vitro показал чувствительность уропатогенных бактерий к коммерчески доступному бактериофагу Pyo 41%.Циклы адаптации бактериофага Pyo дополнительно повысили его чувствительность до 75%. В нашей пилотной серии in vivo бактериальные титры снизились после лечения бактериофагом у шести из девяти пациентов (67%). Неблагоприятных явлений, связанных с бактериофагами, не обнаружено, но у одного пациента развилась лихорадка из-за инфекции P. aeruginosa с восстановлением симптомов при лечении антибиотиками.

Наше исследование было разработано для оценки осуществимости, переносимости и безопасности, а также для оценки клинических / микробиологических результатов коммерчески доступных адаптированных бактериофагов Pyo перед плацебо-контролируемым двойным слепым РКИ (Leitner et al., 2017). Мы не исследовали состав постоянно адаптируемого коктейля бактериофага Pyo, например, с помощью метагеномного анализа, как недавно описано для ранее использовавшихся коктейлей бактериофага Pyo (Villarroel et al., 2017; McCallin et al., 2018), где также сообщалось что в результате адаптации титр отдельных включенных клонов бактериофагов может изменяться. Мы ожидаем, что подробное разъяснение состава коктейлей с бактериофагами, а также понимание механизмов, лежащих в основе бактериофаговой инфекции или устойчивости бактерий, станут более актуальными, как только будут описаны более убедительные результаты об эффективности бактериофаговой терапии.

Бактериофаготерапия уже десятилетиями практикуется в странах Восточной Европы (Чанишвили, 2012), и многие люди знают о ее существовании (дополнительные ссылки см. Также в Дополнительных материалах, частично на русском языке). В настоящем открытом новаторском исследовании плацебо-контролируемого двойного слепого РКИ коммерчески доступный препарат Pyo bacteriophage использовался для лечения девяти пациентов, которым была запланирована ТУРП и которым был поставлен диагноз ИМП. Терапия бактериофагом была начата только после положительного результата анализа in vitro на чувствительность изолированного уропатогена с коктейлем бактериофага Pyo и не вызвала каких-либо побочных эффектов, таких как повышение температуры тела, головная боль, гематурия или аллергическая реакция в восьми из восьми случаев. девять пациентов.Только в одном случае (№9) на 3-и сутки после операции на простате наблюдалась лихорадка. После внезапного повышения температуры тела (38,5 ° C) лечение бактериофагом было прекращено, назначен цефалоспорин третьего поколения. Через 48 ч после начала антибактериальной терапии температура тела нормализовалась (24 ч: 37,8 ° C; 48 ч: <37,5 ° C). В данном конкретном случае инфекция была вызвана P. aeruginosa , который, как известно, выделяет эндотоксины во время своего лизиса.

Вторичное бактериологическое исследование образцов мочи, взятых после обработки бактериофагом, продемонстрировало положительную тенденцию в терапии инфекции, в частности, снижение количества бактерий в диапазоне от 1 до 5 log (случаи № 1, 2, 5, 6).В одном случае (№ 6) вторичный бактериологический анализ после терапии бактериофагом показал, что моча стала ниже предела обнаружения среды Uriselect TM 4 (10 4 КОЕ / мл для уропатогенов). В двух случаях (№4, №8) исходные инфекции, E. coli (титр 10 7 КОЕ / мл) и Enterococcus (титр 10 6 КОЕ / мл), соответственно, исчезли после бактериофага. терапия; однако наблюдалось присутствие непатогенной микрофлоры, которая не требовала дальнейшего лечения.Примечательно, что в этих двух случаях непатогенная флора появилась у пациентов в возрасте 69–80 лет, что может быть результатом затруднения мочеиспускания, сохраняющегося даже после операции. В одном случае (№ 3) титр E. coli не изменился после обработки бактериофагом. В случае (№7) начальная инфекция, вызванная Enterococcus (титр 10 6 КОЕ / мл) после бактериофаговой терапии была заменена на E. coli (титр 10 7 КОЕ / мл), что может быть отнесено на счет к вторичной инфекции.

Хотя дизайн и количество случаев, а также разнообразие результатов, описанных в этой публикации, не позволяют сделать какие-либо статистически надежные выводы, тенденция, указанная в данных нашего исследования, не является самостоятельной и хорошо соответствует результату. из нескольких других недавно зарегистрированных случаев использования бактериофаговой терапии в западных странах (Abedon et al., 2017). Что касается безопасности, результаты нашего проспективного двухфазного исследования подтверждают ранее сделанные выводы о том, что терапия бактериофагами с использованием коктейлей бактериофагов широкого спектра действия, включая бактериофаг Pyo, безопасна (McCallin et al., 2013, 2018; Sarker et al., 2016). Однако для окончательного вывода об эффективности лечения бактериофагами срочно необходимы хорошо спланированные РКИ.

Из-за слишком широкого использования антибиотиков в современном обществе появление патогенов, резистентных к антибиотикам, стало серьезной проблемой с точки зрения повышения показателей заболеваемости и смертности, а также повышенных затрат на здравоохранение, что было доведено до сведения общественности в нескольких странах. и международные агентства по охране здоровья (CDC, 2013; European Center for Disease et al., 2017; Leitner et al., 2017). Поскольку механизм устойчивости бактерий к бактериофагам отличается от механизма устойчивости к антибиотикам, а также поскольку бактериофаги являются самовоспроизводящимися и саморазвивающимися объектами, терапия бактериофагом может использоваться в качестве альтернативного метода устранения устойчивых к антибиотикам бактерий. Одним из основных ограничений для принятия и повторного применения бактериофаговой терапии является отсутствие плацебо-контролируемых двойных слепых РКИ в соответствии с западными стандартами (Круглый стол экспертов по принятию и повторному внедрению бактериофаговой терапии, 2016).Мы ожидаем, что рандомизированное контролируемое исследование, которое мы предшествовали настоящему открытому исследованию, будет способствовать заключению об эффективности, стоимости и преимуществах бактериофагов в случае устойчивых к антибиотикам уропатогенных бактерий.

Наконец, мы хотели бы отметить, что до того, как бактериофаги смогут стать общепринятыми и широко применяться для лечения определенных бактериальных инфекций, как это уже практикуется в нескольких странах Восточной Европы, законодательная база в западном мире должна быть скорректирована. Поскольку внутренняя сила бактериофагов связана с их потенциалом антагонистической эволюции с их бактериальными хозяевами, состав эффективных коктейлей бактериофагов не будет статическим, а будет адаптироваться и корректироваться с течением времени, что обеспечивает эффективность в отношении развития бактериальных инфекций в разные моменты времени в разных местах для разных группы пациентов.Однако такой динамичный подход несовместим с сегодняшними требованиями к производству и допуску химических препаратов. Хотя бактериофаги используются уже довольно давно, примечательно признать, что на самом деле более индивидуальная разработка и применение бактериофагов соответствуют растущим потребностям и возможностям, связанным с индивидуальным питанием и персонализированной медициной. Недавний прорыв в этой дискуссии был отмечен в Бельгии, где национальные власти договорились о создании практической системы бактериофаговой терапии, которая касается магистрального приготовления (фармацевтическая аптека в Соединенных Штатах) индивидуальных бактериофаговых препаратов (Pirnay et al., 2018). Ожидается, что эта бельгийская система «магистральной медицины бактериофагов» будет достаточно гибкой для использования и дальнейшего изучения специфической природы бактериофагов как сопутствующих антибактериальных средств, отдавая приоритет безопасности пациентов.

Заключение

В нашем проспективном двухфазном исследовании, предшествовавшем плацебо-контролируемому двойному слепому РКИ, адаптационные циклы повысили чувствительность in vitro 118 штаммов к коммерчески доступному бактериофагу Pyo с 41% до 75%.В экспериментальной серии in vivo можно было продемонстрировать многообещающий клинический и микробиологический эффект и отличную переносимость адаптированного лечения бактериофагом Pyo. Наши результаты показывают, что терапия бактериофагом может быть эффективной и безопасной для лечения ИМП. Таким образом, хорошо спланированные рандомизированные контролируемые исследования весьма оправданы для дальнейшего определения роли этого потенциально революционного варианта лечения.

Авторские взносы

Все авторы внесли свой вклад в разработку и организацию клинического исследования.AU проводила обработку бактериофагом. NC и MG провели все работы, связанные с бактериофагами. NC и WS составили рукопись. AU, MG, UM и AC критически рассмотрели рукопись. LL и TK сделали окончательное редактирование рукописи. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.

Финансирование

Это исследование было поддержано Швейцарским фондом Continence (www.swisscontinencefoundation.ch), Швейцарским национальным научным фондом (www.snsf.ch) и Швейцарским агентством по развитию и сотрудничеству в рамках программы SCOPES (Scientific co- операция между Восточной Европой и Швейцарией, грант No.152304).

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2018.01832/full#supplementary-material

Сноска

  1. http: // ctep.Cance.gov/protocolDevelopment/electronic_applications/ctc.htm

Список литературы

Абрамс, П., Кардозо, Л., Фолл, М., Гриффитс, Д., Розье, П., Ульмстен, У. и др. (2002). Стандартизация терминологии функции нижних мочевыводящих путей: отчет подкомитета по стандартизации международного общества сдерживания. Neurourol. Уродын. 21, 167–178. DOI: 10.1002 / nau.10052

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Аппельманс, Р.(1921). Le дозировка бактериофагов. C. R. Soc. Биол. 85, 1098–1099.

Google Scholar

Барри, М. Дж., Фаулер, Ф. Дж. Мл., О’лири, М. П., Брускевиц, Р. К., Хольтгрев, Х. Л., Мебуст, В. К. и др. (1992). Индекс симптомов доброкачественной гиперплазии предстательной железы, разработанный американской урологической ассоциацией. Измерительный комитет американской урологической ассоциации. J. Urol. 148, 1549–1557; обсуждение 1564. doi: 10.1016 / S0022-5347 (17) 36966-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бонкат, Г., Пикард, Р., Бартолетти, Р., Кай, Т., Брюьер, Ф., Герлингс, С. Э. и др. (2018). Рекомендации Европейской ассоциации урологов (EAU) по урологическим инфекциям. Доступно по адресу: http://uroweb.org/guideline/urological-infections/ [по состоянию на 11 апреля 2018 г.].

Google Scholar

Чанишвили, Н. (2012). Обзор литературы по практическому применению исследования бактериофагов. Тбилиси: Институт бактериофага, микробиологии и вирусологии им. Георгия Элиава.

Google Scholar

Cornu, J. N., Ahyai, ​​S., Bachmann, A., De La Rosette, J., Gilling, P., Gratzke, C., et al. (2015). Систематический обзор и метаанализ функциональных исходов и осложнений после трансуретральных процедур по поводу симптомов нижних мочевых путей, вызванных доброкачественной обструкцией предстательной железы: обновленная информация. Eur. Урол. 67, 1066–1096. DOI: 10.1016 / j.eururo.2014.06.017

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Европейский центр профилактики и контроля заболеваний, Европейское агентство по безопасности пищевых продуктов и Европейское агентство по лекарственным средствам (2017).Второй совместный отчет ECDC / EFSA / EMA о комплексном анализе потребления противомикробных препаратов и возникновения устойчивости к противомикробным препаратам у бактерий, полученных от людей и сельскохозяйственных животных. EFSA J. 15: 4872.

Google Scholar

Круглый стол экспертов по принятию и повторному внедрению бактериофаговой терапии (2016). Шелковый путь к принятию и повторному внедрению бактериофаговой терапии. Biotechnol. J. 11, 595–600. DOI: 10.1002 / биот.201600023

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Грация, А. (1936). Численное соотношение между лизогенными бактериями и фаговыми частицами, которые они несут. Ann. Inst. Пастер 57, 652–676.

Google Scholar

Хутон, Т. М., Брэдли, С. Ф., Карденас, Д. Д., Колган, Р., Герлингс, С. Е., Райс, Дж. С. и др. (2010). Диагностика, профилактика и лечение катетер-ассоциированной инфекции мочевыводящих путей у взрослых: Международное руководство по клинической практике 2009 г. от общества инфекционистов Америки. Clin. Заразить. Дис. 50, 625–663. DOI: 10.1086 / 650482

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Купелиан В., Вей, Дж. Т., О’лири, М. П., Кусек, Дж. У., Литман, Х. Дж., Линк, К. Л. и др. (2006). Распространенность симптомов со стороны нижних мочевыводящих путей и их влияние на качество жизни в случайной выборке, различающейся по расовому и этническому признаку: обследование здоровья населения Бостонской области (BACH). Arch. Междунар. Med. 166, 2381–2387. DOI: 10.1001 / archinte.166.21.2381

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Куттер, Э., Де Вос, Д., Гвасалия, Г., Алавидзе, З., Гогохия, Л., Куль, С., и др. (2010). Фаготерапия в клинической практике: лечение инфекций человека. Curr. Pharm. Biotechnol. 11, 69–86. DOI: 10.2174 / 138920110790725401

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лейтнер, Л., Сибесма, В., Чанишвили, Н., Годердзишвили, М., Чхотуа, А., Уджмаджуридзе, А. и др. (2017).Бактериофаги для лечения инфекций мочевыводящих путей у пациентов, перенесших трансуретральную резекцию простаты: рандомизированное плацебо-контролируемое двойное слепое клиническое исследование. BMC Urol. 17:90. DOI: 10.1186 / s12894-017-0283-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мартин, С. А., Харен, М. Т., Маршал, В. Р., Ланге, К., Виттерт, Г. А., и участники исследования мужского старения Флори Аделаиды (2011). Распространенность и факторы, связанные с неосложненным хранением и опорожнением нижних мочевыводящих путей у мужчин из Австралии. Мир J. Urol. 29, 179–184. DOI: 10.1007 / s00345-010-0605-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

МакКаллин, С., Алам Саркер, С., Барретто, К., Султана, С., Бергер, Б., Хук, С. и др. (2013). Анализ безопасности коктейля российских фагов: от метагеномного анализа до перорального применения у здоровых людей. Вирусология 443, 187–196. DOI: 10.1016 / j.virol.2013.05.022

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

МакКаллин, С., Саркер, С.А., Султана, С., Охслин, Ф., и Брюссоу, Х. (2018). Метагеномный анализ российских и грузинских коктейлей пиофагов и плацебо-контролируемое испытание безопасности одного фага по сравнению с коктейлем фага у здоровых носителей Staphylococcus aureus . Environ. Microbiol. DOI: 10.1111 / 1462-2920.14310 [Epub перед печатью].

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мерабишвили, М., Пирнай, Ж.-П., и Де Вос, Д. (2018). «Рекомендации по составлению идеального коктейля бактериофагов», в Терапия бактериофагом: от лаборатории к клинической практике , ред.Азередо и С. Силланкорва (Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Springer), 99–110.

Google Scholar

Николь, Л. Е., Брэдли, С., Колган, Р., Райс, Дж. К., Шеффер, А., и Хутон, Т. М. (2005). Руководство Американского общества инфекционистов по диагностике и лечению бессимптомной бактериурии у взрослых. Clin. Заразить. Дис. 40, 643–654. DOI: 10.1086 / 427507

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Pirnay, J.-P., Verbeken, G., Ceyssens, P.-J., Huys, I., De Vos, D., Ameloot, C., et al. (2018). Магистральный фаг. Вирусы 10: E64. DOI: 10.3390 / v10020064

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Саркер, С.А., Султана, С., Ройтелер, Г., Мойн, Д., Декомб, П., Чартон, Ф. и др. (2016). Пероральная фаговая терапия острой бактериальной диареи двумя препаратами колифага: рандомизированное испытание на детях из Бангладеш. EBioMedicine 4, 124–137. DOI: 10.1016 / j.ebiom.2015.12.023

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Schneidewind, L., Kranz, J., Schlager, D., Barski, D., Muhlsteadt, S., Grabbert, M., et al. (2017). Многоцентровое исследование по антибиотикопрофилактике, инфекционным осложнениям и оценке риска при ТУР-П. Cent. Европейский J. Urol. 70, 112–117. DOI: 10.5173 / ceju.2017.941

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Sybesma, W., Zbinden, R., Chanishvili, N., Kutateladze, M., Чхотуа А., Уджмаджуридзе А. и др. (2016). Бактериофаги как потенциальное средство лечения инфекций мочевыводящих путей. Фронт. Microbiol. 7: 465. DOI: 10.3389 / fmicb.2016.00465

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Труцци, Дж. К., Алмейда, Ф. М., Нуньес, Э. К., и Сади, М. В. (2008). Остаточный объем мочи и инфекция мочевыводящих путей - когда они связаны? J. Urol. 180, 182–185. DOI: 10.1016 / j.juro.2008.03.044

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вильярроэль, Дж., Ларсен, М.В., Килструп, М., и Нильсен, М. (2017). Метагеномный анализ терапевтических коктейлей фагов PYO с 1997 по 2014 гг. Вирусы 9: E328. DOI: 10.3390 / v9110328

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

.

Бактериофаг - Biology LibreTexts

Бактериофаг - это вирусы, поражающие бактерии. Из-за их очень большого количества потомков и способности рекомбинировать при смешанных инфекциях (более одного штамма бактерий в инфекции) они широко используются для определения генов с высоким разрешением. Многое из того, что мы знаем о тонкой генетической структуре до появления методов выделения и секвенирования генов, основано на исследованиях бактериофагов.

Бактериофаги были мощной модельной генетической системой, потому что они имеют небольшие геномы, короткий жизненный цикл и дают много потомков из инфицированной клетки.Они предоставляют очень эффективные средства для переноса ДНК в клетки или между ними. Большое количество потомков позволяет измерять очень редкие события рекомбинации.

Литический бактериофаг образует бляшек на лужайках бактерий; это районы расчистки, где лизировались инфицированные бактерии. Ранние работы были сосредоточены на мутантах с различной морфологией бляшек , например. T2 r , который демонстрирует быстрый лизис и генерирует более крупные бляшки, или на мутантах с различными диапазонами хозяев , e.грамм. T2 h , который убивает оба штамма хозяина B и B / 2.

Тест цис-транс-комплементации определяет цистрон, который представляет собой ген

Сеймур Бензер использовал локус r II фага T4 для определения генов на основании их поведения в тесте комплементации, а также для обеспечения фундаментального понимания структуры генов (в частности, расположения мутабельных сайтов - см. следующий раздел). Различие в морфологии бляшек между фагами r и r + легко увидеть (большие и маленькие, соответственно), и Бензер выделил множество мутантов r фага Т4.Фаг дикого типа, но не любые мутанты rII , будет расти на штамме E. coli K12 (l), тогда как фаг дикого типа и мутантный фаг одинаково хорошо растут на штамме E. coli B. дикий фенотип легко обнаружить по его способности расти в штамме K12 (l).

Если E. coli штамм K12 (l) коинфицирован 2 фагами, несущими мутации в разных положениях в rIIA , вы не получите размножения фага (за исключением чрезвычайно редких рекомбинантов дикого типа, которые встречаются в примерно 1 из 106 потомков).На схеме ниже каждая линия представляет хромосому одного из родительских фагов.

РИИА РИИБ

фаг 1 _ | __x ______ | ________ | _

фаг 2 _ | _______ x_ | ________ | _

Аналогичным образом, если два фага в коинфекции несут мутации в разных положениях в rIIB , вы не получите размножения фага (за исключением чрезвычайно редких рекомбинантов дикого типа, примерно 1 из 106).

РИИА РИИБ

фаг 3 _ | _________ | _x ______ | _

фаг 4 _ | _________ | ______ x_ | _

Однако, если один из коинфекционных фагов несет мутацию в rIIA , а другой - в rIIB , то вы видите размножение фага, формирующее очень большое количество бляшек на E. coli штамм К12 (л).

РИИА РИИБ

фаг 1 _ | __x ______ | ________ | _ Обеспечивает белок rIIB wt

фаг 4 _ | _________ | ______ x_ | _ Обеспечивает белок rIIA wt

Вместе эти два фага обеспечивают все функции фага - они дополняют друг друга. Это положительный тест на комплементарность. Первые два примера не показывают дополнения, и мы помещаем их в одну группу дополнений . Мутанты, которые не дополняют друг друга, помещаются в одну и ту же группу комплементации; это разные мутантные аллели одного и того же гена.Бензер показал, что существует две группы комплементации (и, следовательно, два гена) в локусе r II , который он назвал A и B.

Упражнение 1.3

При смешанном заражении фагом 1 и фагом 4 вы также получаете редкие рекомбинанты дикого типа, но их больше, чем наблюдается при коинфекциях с различными мутантными аллелями. Зачем?

Эксперименты Бензера по анализу локуса rII бактериофага Т4 формализовали идею теста на комплементацию цис-транс для определения цистрона , который является рабочим определением гена.Во-первых, давайте определим цис и транс , когда они используются для обозначения генов. В конфигурации цис обе мутации находятся на одной хромосоме. В конфигурации trans каждая мутация находится на другой хромосоме

Мутации в одном и том же гене не будут комплементировать в trans , тогда как мутации в разных генах будут дополнять trans (рисунок 1.12). В конфигурации cis другая хромосома является диким типом, и этот хромосома будет дополнять любую рецессивную мутацию.Группа комплементации соответствует генетической сущности, которую мы называем цистроном , она эквивалентна гену .

Этот тест требует диплоидной ситуации. Это может быть природный диплоид (по 2 копии каждой хромосомы), частичный или меродиплоид, например путем конъюгирования с клеткой, несущей фактор F '. Некоторые бактериофаги несут части хромосомы хозяина; это называется трансдукцией фага . Заражение E. coli трансдуцирующим фагом, несущим мутацию в гене хозяина, является еще одним способом создания меродиплоида в лаборатории для анализа комплементации.

Рисунок 1.12 . Тест комплементации определяет цистрон и различает два гена.

Рекомбинация внутри генов позволяет построить линейную карту мутабельных сайтов, составляющих ген

Как только анализ рекомбинации показал, что хромосомы представляют собой линейные массивы генов, их стали рассматривать как «жемчужную нить» с генами, или «жемчужины», разделенные некоторым негенетическим материалом (рис. 1.13). Считалось, что этот предполагаемый негенетический материал является местом рекомбинации, тогда как гены, единицы наследования, считались устойчивыми к рекомбинации.Однако, исследуя большое количество потомков бактериофаговых инфекций, можно продемонстрировать, что рекомбинация может происходить внутри гена . Это поддерживает вторую модель, показанную на рисунке 1.13. Из-за плотной упаковки кодирующих областей в геномах фагов рекомбинация почти всегда происходит внутри генов бактериофага, но в геномах со значительными некодирующими областями между генами рекомбинация может происходить и между генами.

Рисунок 1.13. Модели генов либо в виде дискретных изменяемых единиц, разделенных негенетическим материалом (вверху), либо как части непрерывного генетического материала (внизу).

Тесты между этими двумя моделями требовали скрининга генетических маркеров (мутаций), которые очень близки друг к другу. Когда два маркера находятся очень близко друг к другу, частота рекомбинации чрезвычайно мала, поэтому необходимо исследовать достаточное количество потомков, чтобы определить расстояния карты, скажем, 0,02 сантиМоргана = 0,02 единицы карты = 0,02% рекомбинантов.Это означает, что 2 из 10 000 потомков будут демонстрировать рекомбинацию между двумя маркерами, которые находятся на расстоянии 0,02 единицы карты друг от друга, и, очевидно, необходимо исследовать по крайней мере 10 000 потомков, чтобы надежно подсчитать эту рекомбинацию. В этом сила микробной генетики - вы действительно можете отобрать или отсеять это множество потомков, иногда довольно легко.

Пример рекомбинации в фаге показан на рисунке 1.14. Фаг Т2 дикого типа образует небольшие бляшки и убивает только E. coli штамм B.Таким образом, различные аллели h можно различить путем посева на смесь штаммов E. coli B и B / 2. Фаг, несущий мутантный аллель h , будет генерировать прозрачные бляшки, поскольку они убивают оба штамма. Фаг дикого типа h + дает мутные бляшки, поскольку лизируются не B / 2-клетки, а B-клетки. Когда смесь E. coli штаммов B и B / 2 коинфицированы как T2 hr , так и T2 h + r + , получают четыре типа бляшек.Большинство из них имеют родительский фенотип: прозрачный и большой или мутный и маленький. Эти бляшки содержат фаг-потомок, который сохраняет родительские генотипы T2 hr и T2 h + r + , соответственно. Два других фенотипа не являются родительскими, то есть прозрачные и маленькие или мутные и большие. Они происходят от потомства с рекомбинантными генотипами, то есть T2 hr + и T2 h + r . При этой смешанной инфекции рекомбинация произошла между двумя фаговыми геномами в одной и той же клетке.

Рисунок 1.14. Рекомбинация в бактериофаге

Первая демонстрация рекомбинации внутри гена была получена при работе с генами rIIA и rIIB фага Т4. В этих экспериментах Сеймура Бензера, опубликованных в 1955 году, использовались методы, подобные показанной на рис. 1.14. Помните, что мутации в гене r вызывают быстрый лизис инфицированных клеток, т. Е. Продолжительность литического цикла короче. Разницу в морфологии бляшек между фагами r и r + легко увидеть (большие и маленькие, соответственно).Эти два гена очень близки друг к другу, и многие мутации были независимо изолированы в каждом. Это было резюмировано выше при обсуждении дополнения.

Рассмотрим результаты заражения бактериальной культуры двумя мутантными аллелями гена rIIA.

T4 rIIA6 _ | _______________________ x ______ | _

и T4 rIIA27 _ | _______ x ______________________ | _

(x обозначает положение мутации в каждом аллеле).

Потомство фага от этой инфекции включает фагов с родительским генотипом (в подавляющем большинстве) и с гораздо меньшей частотой - два типа рекомбинантов:

дикий тип T4 r + _ | ______________________________ | _

двойной мутант T4 rIIA6 rIIA27 _ | _______ x _______________ x ______ | _

Дикий тип легко оценивается, потому что он, а не какие-либо мутанты rII , будут расти на штамме E. coli K12 (l), тогда как фаг дикого типа и мутантный фаг одинаково хорошо растут на E.coli B. Таким образом, вы можете выбрать для дикого типа (и вы увидите только желаемый рекомбинант). Обнаружение двойных мутантов более трудоемко, поскольку их получают только путем скрининга потомства, тестирования фага, который при обратном скрещивании с родительским фагом не приводит к образованию рекомбинантного потомства дикого типа.

Было получено равное количество рекомбинантов дикого типа и двойных мутантов, что показывает, что рекомбинация может происходить внутри гена и что это происходит путем реципрокного кроссинговера.Если бы рекомбинация происходила только между генами, то фаг дикого типа не получился бы. Большой спектр значений рекомбинации был получен при скрещивании различных аллелей, точно так же, как вы получаете при скрещивании мутантов в отдельных генах.

В результате этих экспериментов по рекомбинации генов rII можно сделать несколько важных выводов.

  1. В пределах гена встречается большого количества мутирующих сайтов , что превышает примерно 500 для генов rIIA и rIIB .Теперь мы понимаем, что они соответствуют отдельным парам оснований внутри гена.
  2. Генетические карты четко линейны , что указывает на линейность гена. Теперь мы знаем, что ген - это линейный полимер нуклеотидов.
  3. Большинство мутаций - это изменения в одном мутабельном сайте ( точечных мутаций ). Многие гены могут быть восстановлены до дикого типа, претерпев обратную мутацию в том же сайте (, реверсия ).
  4. Другие мутации вызывают делецию одного или нескольких мутабельных сайтов, что отражает физическую утрату части гена rII .При удалении одного или нескольких изменяемых сайтов (пары оснований) крайне маловероятно, что они вернутся к исходному дикому типу.

Один ген кодирует один полипептид

Одно из фундаментальных открытий того, как функционируют гены, состоит в том, что один ген кодирует один фермент (или, точнее, один полипептид ). Бидл и Татум пришли к такому выводу на основе анализа комплементации генов, необходимых для биосинтеза аргинина у грибов. Они показали, что мутация в каждом гене приводит к потере активности одного фермента в многоступенчатом пути биосинтеза аргинина.Как обсуждалось выше в разделе о генетическом вскрытии, большое количество ауксотрофов Arg (требующих Arg для роста) было выделено, а затем организовано в набор групп комплементации, где каждая группа комплементации представляет ген.

Классическая работа Бидла и Татума продемонстрировала прямую связь между генами, определяемыми ауксотрофными мутантами, и ферментами, необходимыми для биосинтеза Arg. Они показали, что мутация в одном гене приводит к потере одной конкретной ферментативной активности, т.е.грамм. в обобщенной схеме ниже мутация в гене 2 привела к потере активности фермента 2. Это привело к накоплению субстрата для этой реакции (промежуточное соединение N на диаграмме ниже). Если было 4 группы комплементации для ауксотрофов Arg, то есть 4 гена, то на пути биосинтеза Arg было обнаружено 4 фермента. На каждый фермент повлияли мутации в одной из групп комплементации.

Промежуточные звенья:

M ® N ® O ® P ® Arg

фермент 1 фермент 2 фермент 3 фермент 4

ген 1 ген 2 ген 3 ген 4

Рисунок 1.15. Общая схема, показывающая взаимосвязь между промежуточными продуктами метаболизма (M, N, O, P) и конечным продуктом (Arg), ферментами и генами, которые их кодируют.

Как правило, каждая стадия метаболического пути катализируется ферментом (идентифицированным биохимически), который является продуктом определенного гена (идентифицированного мутантами, неспособными синтезировать конечный продукт или неспособными расщеплять исходное соединение) пути ). Количество генов, которые могут генерировать ауксотрофные мутанты, (обычно) равно количеству ферментативных стадий на пути.Ауксотрофные мутанты в данном гене не имеют соответствующего фермента. Таким образом, Бидл и Татум пришли к выводу, что один ген кодирует один фермент. Иногда для кодирования фермента требуется более одного гена, потому что фермент имеет несколько разных полипептидных субъединиц. Таким образом, каждый полипептид кодируется геном .

Промежуточные продукты метаболизма, которые накапливаются в каждом мутанте, можно использовать для размещения ферментов в порядке из действий в пути. На схеме на рисунке 1.15, мутанты в гене 3 накапливают вещество О. Кормление веществом О мутантов в гене 1 или гене 2 позволяет расти в отсутствие Arg. Мы пришли к выводу, что дефекты в ферменте 1 или ферменте 2, соответственно, находятся выше фермента 3. Напротив, скармливание вещества O мутантам в гене 4 не приведет к росту в отсутствие Arg. Несмотря на то, что этот мутант может преобразовывать вещество O в вещество P, у него нет активного фермента 4 для преобразования P в Arg. Неспособность мутантов гена 4 расти на веществе O показывает, что фермент 4 находится ниже фермента 3.

Упражнение 1.4

Представьте, что вы изучаете биосинтез серина у гриба. Вы выделяете сериновые ауксотрофы, проводите все попарные скрещивания мутантов и обнаруживаете, что ауксотрофы можно сгруппировать в три группы комплементации, называемые A, B и C. Вы также обнаруживаете, что различные промежуточные метаболические соединения накапливаются в членах каждой группы комплементации - субстанции. A в ауксотрофах в группе комплементации A, вещество B в группе комплементации B и вещество C в группе комплементации C.Каждый из промежуточных продуктов вводится ауксотрофам из каждой из трех групп комплементации, как указано в таблице ниже. А + означает, что ауксотроф был способен расти в среде в отсутствие серина при скармливании указанного вещества; а - означает отсутствие роста в отсутствие серина.

Федеральный резерв:

мутант в группе комплементации A

мутант в группе комплементации B

мутант в группе комплементации C

вещество A

+

+

вещество B

вещество C

+

В пути биосинтеза серина у этого гриба, каков порядок ферментов, кодируемых в трех группах комплементации? Фермент A кодируется геном, который при изменении генерирует мутанты, которые попадают в группу комплементации A и т. Д.

Ген и его полипептидный продукт колинеарны

После того, как было определено, что ген представляет собой линейный массив изменяемых сайтов, что гены состоят из цепочки нуклеотидов, называемых ДНК (см. Главу 2), и что каждый ген кодирует полипептид, оставалось определить, как именно это строка нуклеотидов, кодирующая конкретную аминокислотную последовательность. Эта проблема изучалась по нескольким направлениям, кульминацией которых стало важнейшее достижение второй половины -го века - расшифровка генетического кода.Подробное назначение конкретных кодонов (триплетов соседних нуклеотидов) будет обсуждаться в главе 13. В следующих нескольких разделах этой главы мы исследуем, как были расшифрованы некоторые из основных характеристик генетического кода.

Априори , кодирующие единицы в гене могут кодировать как состав, так и адрес для каждой аминокислоты, как проиллюстрировано в модели 1 на рисунке 1.17. В этой модели кодирующие единицы могут быть скремблированы и по-прежнему определять один и тот же белок.В такой ситуации полипептид не будет колинеарен с геном.

Рисунок 1.16. Альтернативные модели для структуры гена и кодона.

В альтернативной модели (модель 2 на рис. 1.16) единицы кодирования определяют только состав, но не положение аминокислоты. «Адрес» аминокислоты определяется положением кодирующей единицы в гене. Эта модель предсказывает, что ген и его полипептидный продукт будут колинеарными - e.грамм. мутация в 5-й кодирующей единице повлияет на 5-ю аминокислоту белка и т. д.

Чарльз Янофски и его сотрудники (1964) протестировали эти две модели и определили, что ген и полипептидный продукт действительно колинеарны . Они использовали частоты рекомбинации для картирования положений различных мутантных аллелей в гене, кодирующем определенную субъединицу фермента триптофансинтазы. Затем они определили аминокислотную последовательность полипептидов дикого типа и мутантных полипептидов.Как показано на рисунке 1.17, положение мутантного аллеля на рекомбинационной карте гена соответствует положению измененной аминокислоты в продукте мутантного полипептида. Например, аллель A101 отображается на одном конце гена, а соответствующая замена Glu® Val находится рядом с N-концом полипептида. Аллель A64 картируется рядом с другим концом гена, и соответствующая замена Ser ® Leu находится рядом с С-концом полипептида.Это соответствие между положениями мутаций в каждом аллеле и положениями последующих изменений в полипептиде показывает, что Модель 1 может быть исключена, а Модель 2 поддерживается.

Рисунок 1.17. Полипептид коллинеарен гену.

Мутабельные сайты представляют собой пары оснований вдоль двойной спирали

Большое количество мутабельных сайтов, обнаруженных в каждом гене, между которыми может происходить рекомбинация, позволяет сделать вывод, что мутабельные сайты представляют собой пары оснований вдоль ДНК.Определение последовательности генов дикого типа и мутантных генов подтверждает этот вывод.

Отдельные аминокислоты определяются тремя соседними нуклеотидами, которые являются кодонами

Этот вывод требует трех частей информации.

Прежде всего, соседних мутабельных сайтов определяют аминокислоты . Чтобы прийти к такому выводу, потребовалось исследование тонкой структуры гена, включая редкую рекомбинацию между очень тесно связанными мутациями внутри гена. Яновский и его коллеги, работая с мутациями гена trpA E.coli , кодирующая триптофансинтазу, показала, что разные аллели, мутировавшие в одном и том же кодоне, могут рекомбинировать (хотя и с очень низкой частотой). (Это та же лаборатория и та же система, которые использовались, чтобы показать, что ген и его полипептидный продукт коллинеарны.) Таким образом, внутри кодона может происходить рекомбинация между двумя разными аллелями, что означает, что кодон должен иметь более одного мутабельного сайта. Теперь мы понимаем, что мутабельный сайт - это нуклеотид в ДНК. Таким образом, соседние мутабельные сайты (нуклеотиды) кодируют одну аминокислоту.

Рассмотрим это подробнее (рис. 1.18). Янофски и его коллеги исследовали два разных мутантных аллеля trpA , каждый из которых вызывал изменения в аминокислоте 211 триптофансинтазы. В мутантном аллеле A23 Gly дикого типа превращается в мутантный Arg. В мутантном аллеле A46 Gly дикого типа превращается в мутантный Glu.

G GA (Gly 211) -> A GA (Arg 211) мутантный аллель A23

G G A (Gly 211) -> G A A (Glu 211) мутантный аллель A46

A23 ´ A46 A GA ´ G A A® GGA (Gly 211 дикого типа в 2 из 100 000 потомков)

Рисунок 1.18. Рекомбинация может происходить между двумя мутантными аллелями, влияющими на один и тот же кодон.

Аллели A23 и A46 не являются альтернативными формами одного и того же мутабельного сайта, потому что рекомбинация с образованием дикого типа происходит, хотя и с очень низкой частотой (0,002%; сайты расположены очень близко друг к другу, фактически в одном кодоне). !). Если бы они включали один и тот же мутабельный сайт, рекомбинант дикого типа никогда бы не увидел.

Второе наблюдение состоит в том, что генетический код не перекрывает .Это было продемонстрировано путем демонстрации того, что мутация в одном сайте изменяет только одну аминокислоту. Это противоречит предсказаниям перекрывающегося кода (см. Рисунок 1.19), и, следовательно, код не должен перекрываться.

Рисунок 1.19. Прогнозирование эффектов нуклеотидных замен, вставок или делеций на полипептиды, кодируемые перекрывающимся, пунктированным или неперекрывающимся непунктурированным кодом.

Третье наблюдение заключается в том, что генетический код читается в тройках с фиксированной начальной точки.Это было показано при изучении эффекта мутации сдвига рамки считывания . Как показано на рисунке 1.19, код без знаков препинания имеет определенную рамку считывания. Предполагается, что вставки или делеции нуклеотидов окажут сильное влияние на кодируемый белок, поскольку они изменят рамку считывания. Тот факт, что это наблюдалось, был одной из основных причин сделать вывод, что молекулы мРНК, кодируемые генами, читаются последовательными блоками из трех нуклеотидов в определенной рамке считывания.

Для последовательности, показанной на рисунке 1.20, вставка A сдвигает рамку считывания, поэтому все аминокислоты после вставки отличаются от последовательности дикого типа. (Четвертая аминокислота по-прежнему является Gly из-за вырожденности кода: и GGC, и GGG кодируют Gly.) Точно так же удаление U изменяет всю последовательность после делеции.

Рисунок 1.20. мутаций сдвига рамки считывания показывают, что генетический код читается в триплетах.

Эти наблюдения показывают, что нуклеотидная последовательность читается или транслируется с фиксированной начальной точки без знаков препинания.Альтернативная модель состоит в том, что группа нуклеотидов, кодирующих аминокислоту (кодон), также может включать сигнал конца кодона (модель 2 на рисунке 1.19). Это можно рассматривать как «запятую» в конце каждого кодона. Если бы это было так, вставки или делеции повлияли бы только на кодон, в котором они происходят. Однако данные показывают, что все кодоны, включая и после того, который содержит вставку или удаление, изменяются. Таким образом, генетический код не прерывается, а читается в конкретном кадре, который определяется фиксированной начальной точкой (Модель 3 на рисунке 1.19). Этой отправной точкой является конкретный AUG, кодирующий метионин. (Подробнее об этом будет рассказано в главе 13).

Результаты мутаций со сдвигом рамки считывания настолько резкие, что белки обычно не работают. Следовательно, скрининг или отбор мутантов с потерей функции часто выявляют эти мутанты со сдвигом рамки считывания. Простые замены нуклеотидов, которые приводят к заменам аминокислот, часто очень слабо влияют на белок и, следовательно, имеют слабые или незаметные фенотипы.

Двойной мутант, полученный кроссинговером между вставкой (+) и делецией (-), приводит к (почти) нормальному фенотипу, т.е.е. возврат вставки или удаления.

Ген, содержащий трех близко расположенных вставок (или делеций) одиночных нуклеотидов, будет производить функциональный продукт . Однако четыре или пять вставок или делеций не дают функционального продукта (Crick, Barnett, Brenner and Watts-Tobin, 1961). Это стало лучшим доказательством того, что генетический код читается группами из трех нуклеотидов (а не двух или четырех). В течение следующих 5 лет кодекс был разработан (к 1966 г.), и этот вывод окончательно подтвердился.

Авторы и указание авторства

.

вирусов, заражающих бактерии · Frontiers for Young Minds

Аннотация

Бактерии могут заражаться крошечными вирусами, называемыми бактериофагами (фагами). Бактериофаги настолько малы, что в них нет даже одной клетки, а вместо этого они представляют собой всего лишь фрагмент ДНК, окруженный белковой оболочкой. Когда они атакуют бактерию, бактериофаги могут очень быстро размножаться, пока бактерия не лопнет и не выпустит много новых фагов. Триллионы бактерий и бактериофагов живут в организме человека и на нем, и они жизненно важны для нормальной и здоровой жизни.Мы заинтересованы в том, чтобы увидеть, можем ли мы использовать фаги, чтобы помочь врачам лечить болезни и помочь людям вести здоровый образ жизни.

Микробиом - новый орган человека?

Представьте себе волнение, если бы врачи внезапно обнаружили в теле человека новый орган! Именно это и произошло в последние несколько лет. Теперь мы знаем, что, помимо легких, почек, мозга, печени и сердца, нам нужно рассмотреть еще один орган - микробиом . Этот новый орган совершенно другой, потому что он состоит из микробов , а не из человеческих клеток.Микробы - это крошечные организмы, которые включают бактерий . В этом новом органе удивительно то, что мы рождаемся без него. Когда мы рождаемся, мы получаем бактерии от наших матерей, а затем продолжаем добавлять все больше и больше бактерий из окружающей среды, пока у нас не будет около 1000 различных типов бактерий внутри и внутри нашего тела. Бактерии крошечные, но они могут очень быстро размножаться, и всего за несколько часов одна бактерия может превратиться в тысячи или даже миллионы новых бактерий. У каждого человека уникальный микробиом, отличный от всех остальных.У нас есть микробиомы на всю жизнь. Микробиом в основном расположен в кишечнике, но есть также микробиом кожи и микробиом легких.

Но погодите - бактерии живут с нами всю жизнь? Большинство из нас думает, что бактерии присутствуют только на грязных вещах, но они есть везде, в том числе внутри нас. Бактерии не просто вызывают у нас болезни - они могут выполнять множество полезных задач, например превращать молоко в йогурт и сыр или помогать растениям расти. Нам нужны бактерии в нашем микробиоме, чтобы помогать нам переваривать пищу и «тренировать» нашу иммунную систему, а также выполнять другие важные функции.Сотни лабораторий по всему миру работают над пониманием других ролей, которые микробиом играет в здоровье человека. Исследования показали, что люди с определенными заболеваниями и состояниями, такими как воспалительное заболевание кишечника или определенные виды рака, имеют микробиомы, отличные от здоровых людей, но было трудно показать, ответственны ли изменения в микробиоме за эти заболевания. В дополнение к связи микробиома с проблемами кишечника и кожи, недавние исследования даже предоставили убедительные доказательства того, что бактерии в кишечнике могут влиять на наш мозг! Например, когда исследователи перенесли микробиом кишечника людей, страдающих депрессией, крысам, животные начали демонстрировать поведение, также характерное для депрессии.Микробиомы людей, не страдающих депрессией, не имели такого эффекта.

Бактериофаги - вирусы, поражающие бактерии

Наши микробиомы содержат триллионы бактерий, обитающих в наших телах и на них, но разнообразие жизни, живущей внутри нас, на этом не заканчивается. Джонатан Свифт, ирландский поэт, написал строки:

.

Итак, натуралисты наблюдают, блоха

Имеет блох поменьше, которые охотятся на него;

А у этих есть еще поменьше, чтобы их укусить,

И так до бесконечности .

Свифт никогда не слышал о микробиоме, но описал его идеально. У нас есть бактерии, которые живут на нас, и бактерии имеют бактериальных вирусов , которые живут на них (рис. 1). Эти вирусы называются бактериофагами (или фагами). Вирусы отличаются от бактерий тем, что они не состоят из клеток, а вместо этого состоят из фрагмента ДНК (или РНК), упакованного внутри белковой оболочки. Вирусы настолько малы, что мы не можем увидеть их в обычный микроскоп. Чтобы дать вам представление об их размере, если бы фаг был размером с точку в конце этого предложения, то люди были бы ростом почти 4 мили (6 км)! Фаги - самые простые и распространенные организмы на Земле.

  • Рис. 1. В нашем микробиоме человека содержится много бактерий, в основном в кишечнике.
  • Эти бактерии могут подвергаться атаке бактериальных вирусов, называемых бактериофагами.

Фаги действительно очень красивы (рис. 2), и способ их размножения весьма интересен. Фаг прикрепляется к бактерии и вводит ее ДНК в бактериальную клетку. Затем бактерия превращается в фабрику фагов, производя до 100 новых фагов, прежде чем взорваться, выпуская фаги для атаки большего количества бактерий.Это означает, что фаги могут расти намного быстрее, чем бактерии. В некоторых странах, особенно в Восточной Европе, фаги действительно используются для лечения бактериальных инфекций. Каждый фаг может убить только один тип бактерий, поэтому, если врач знает, какие бактерии заражают пациента, можно дать пациенту фаг, который может заразить и убить этот тип бактерий. Фаги не могут инфицировать человеческие клетки, поэтому не представляют для нас угрозы.

  • Рис. 2. Бактериофаги имеют белковые головки и хвосты, которые упакованы ДНК.
  • Когда фаг атакует бактерию, он вводит ее ДНК. Их бактерия производит больше фагов, которые высвобождаются, когда бактерия лопается.

Фаги внутри нас

В течение многих лет мы знали, что в кишечнике присутствует много фагов, но на самом деле мы не знали о них очень много. Итак, мы начали их изучать. Сначала мы отделили фаги от всего остального в кишечнике, а затем секвенировали их. Секвенирование позволило нам «прочитать» ДНК фага и предсказать, сколько и каких типов фагов присутствует.Мы были поражены, узнав, что в кишечнике человека есть десятки тысяч различных фагов. Большинство из них были совершенно неизвестны. Некоторые кишечные фаги очень просты и имеют всего три гена, в то время как другие огромны и содержат более 500 генов.

Если в кишечнике присутствует много фагов, и они очень быстро размножаются, почему они просто не уничтожают все кишечные бактерии? Что ж, как это часто бывает в науке, ответ довольно сложен. Иногда фаг просто не может найти свою правильную бактериальную мишень в очень переполненной среде кишечника.Кроме того, бактерии могут защищаться от фагов различными способами, включая предотвращение прикрепления фага, разрушение ДНК фага, когда он входит в клетку, и даже решительный шаг к совершению «самоубийства», чтобы предотвратить размножение фага и его нападение на организм. близкие родственники бактерий. В результате между фагами и бактериями в кишечнике возникает сложный баланс и формируются устойчивые отношения. Бактерии постоянно развиваются для борьбы с фагами, и фаги также быстро развиваются, чтобы преодолеть бактериальную защиту.

Почему так важно изучать бактериофаги?

Почему нас интересуют фаги в кишечнике? Почему кто-то финансирует такие лаборатории, как наша и другие, которые пытаются понять этих простых, но сложных существ? Одна из прекрасных причин заключается в том, что мы можем изучить множество фундаментальных биологических принципов, изучая фаги. Именно по этой причине исследователям фагов было присуждено немало Нобелевских премий. Не далее как в 2018 году Нобелевская премия по химии была присуждена Джорджу Смиту и Грегори Уинтеру, которые использовали тот факт, что фаги быстро растут и мутируют, для разработки новых антител, которые использовались для лечения многих заболеваний, включая некоторые формы рака.

Еще одна причина, по которой мы изучаем фаги в кишечнике, состоит в том, что мы надеемся, что они могут предоставить нам очень точный способ манипулирования или создания микробиома. Наша гипотеза состоит в том, что фаги являются одной из наиболее важных частей микробиома, и мы разрабатываем и проводим эксперименты, чтобы проверить эту идею. Одна вещь, которую мы делаем, - переносим фаг из здорового микробиома в микробиом, поврежденный антибиотиками, чтобы посмотреть, сможем ли мы восстановить здоровый микробиом.

Даже если наша гипотеза окажется неверной, мы почти наверняка многому научимся в процессе.Но если мы правы, то когда-нибудь врачи смогут использовать фаги для преобразования микробиома из нездорового в здоровое состояние, что, возможно, поможет вылечить несколько болезней или расстройств. Возможно, добавив очень большое количество фагов против нескольких конкретных бактерий-мишеней, мы сможем изменить микробиом в положительную сторону. Возможно, в будущем наступит время, когда мы сможем «исправить» поврежденный микробиом с помощью фагов, подобно тому, как хирурги в настоящее время могут оперировать поврежденное сердце или печень.Но это станет возможным только тогда, когда мы намного лучше поймем количество и природу наших фагов, и нужно будет провести так много экспериментов, чтобы добраться до этой точки.

Известный ученый по имени сэр Питер Медавар однажды описал вирусы как «часть плохих новостей, заключенную в белок», но в будущем мы надеемся показать, что фаги - это «возможность, заключенная в белке».

Глоссарий

Микробиом : Совокупность всех микробов в определенной среде, например, в организме человека.

Микроб : Микроскопические организмы, такие как бактерии, грибы и бактериофаги.

Бактерии : Тип микроба. Бактерия - это отдельная клетка, которая может делиться с образованием двух клеток.

Вирус : Тип микроба, который может заражать клетки. Вирусы человека поражают клетки человека, вирусы растений - клетки растений и т. Д.

Бактериофаг : Вирус, поражающий бактерии, также называемый фагом.

ДНК : Молекула, несущая всю информацию в виде генов, необходимых для производства белков. Все организмы получают ДНК от своих родителей.

Конфликт интересов

Автор заявляет, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.


Первоисточник статья

Шкопоров, А.Н. и Хилл С. 2019. Бактериофаги кишечника человека: «известное неизвестное» микробиома. Клеточный микроб-хозяин 25: 195–209. DOI: 10.1016 / j.chom.2019.01.017

. .

Смотрите также